点评丨李大力（华东师范大学）
CRISPR-Cas作为细菌与古菌中的一种识别和摧毁入侵病原体的免疫防御系统，已被用于真核细胞的基因组编辑【1】，被誉为“基因魔剪”。CRISPR/Cas技术已在后基因组时代取得了巨大的成功，开创了遗传疾病精准治疗的新时代【2】。诸如流行的 CRISPR-Cas9 之类的工具已在实验室中被设计用于治愈许多遗传疾病，然而还要遭遇诸多的挑战【3】。其中一项便是这些工具太大而很难有效地递送给患者。尝试将 CRISPR 工具小型化，使其足够小以更高效便捷的递送方法，例如腺病毒相关病毒 (AAV) 载体，一直都是科学界的一大工作。介于Cas9巨大的应用价值，科学家们对 Cas9 小型化以扩大使用范围产生了浓厚的兴趣。可是在小型化Cas9 工具方面，无论是结构引导方法还是定向进化都不是特别成功【4】。康奈尔大学的可爱龙实验室基于最近在转座子中发现的，可能是Cas9进化源头（祖宗）的IscB家族成员，因此可认为是“最老Cas9”，成功获取并解析了其高分辨结构。通过团队优化，进一步将其缩减到450个氨基酸，从尺寸上可称“最小Cas9”。该分子大小仅为Cas9 （接近1400个氨基酸） 的三分之一左右（图1）。这项工作以Structural basis for RNA-guided DNA cleavage by IscB-ωRNA and mechanistic comparison with Cas9 为题，发表在 5 月 26 日的Science杂志上。近年，有研究表明Cas9广泛存在着相关联的同源Isc家族【5, 6】。IscB蛋白是由IS200/IS605转座子超家族一个独特子集编码的推定核酸酶，被认为可能是II型CRISPR效应物Cas9的祖先【7】，这个家族还包含编码tnpB的转座子，也是一种可能的核酸内切酶，被认为是V型CRISPR效应物Cas12的祖先【6】。尽管IscB蛋白在原核生物中广泛分布，并与Cas9共享结构域组成（图1），但其功能和机制还是未知的，因此其结构解析显得尤为重要。图1：Cas9和IscB结合目标DNA后的比较图。左：Cas9; 右：IscB; 橘黄色:guide RNA序列;淡黄色:RNA骨架;红色：non-target strand;蓝色：Target strand;灰色为蛋白骨架，蓝色:HNH核酸酶，紫色:RuvC核酸酶。
可爱龙团队首先在体外获取了高质量的IscB-ωRNA （OMEGA RNA，Obligate Mobile Element Guided Activity RNA）复合物。生化试验表明，该复合物切割目标双链DNA的效率惊人，在纳摩尔量级浓度下，几分钟就能完成双链切割（图2）。图2：IscB基因座与活性示意图。A，IscB基因簇组成，其16 nt长度的Guide RNA区被认为与一段接近200 nt长度的ωRNA融合，IscB基因约1.4 kb。B， IscB能在体外高效实现双链断裂，红色标记Non-target strand (NTS),由RuvC核酸酶负责切割；绿色标记Target strand (TS), 由HNH核酸酶负责切割，并且HNH切割先于RuvC切割。
再通过冷冻电镜高分辨率结构解析，可爱龙团队发现IscB虽然蛋白尺寸很小，但是通过ωRNA系统融合引导 RNA，再将ωRNA 替换 Cas9部分蛋白结构域的方式来实现更小的蛋白尺寸，通俗的说，就是通过“移花接木”的方式，通过ωRNA的折叠来来取代蛋白的折叠。 “这依然是高效的典范，相当于使用多出的100 nt长度的RNA取代了接近1000个氨基酸长度……” “这也符合生命的源头，RNA是更高效的生命活动大分子。RNA的合成、折叠、生化反应效率都要比蛋白质高。毕竟一个氨基酸等于三个RNA碱基……”可爱龙教授表示。不过，IscB 蛋白依旧保持核心化学（DNA切割）反应中心。这可能也暗示，在进化上，蛋白配件可能要比RNA配件更适合做更加精细的操作。movie 1：Cas9 sgRNA（左）和IscB Guide-ωRNA（右）比较。Guide-ωRNA全长大概220 nt, Cas9 sgRNA全长大约120 nt。然而IscB以多余的100 nt RNA替换了Cas9大约1000个氨基酸的功能。
CRISPR/Cas系统最大的关注点可能是其以何种方式去避免脱靶，防止自我损伤？毕竟这与编辑器用于基因编辑治疗的安全性直接相关。可爱龙团队通过多种状态的比较，发现IscB在16个碱基的guide序列和target DNA没有完全形成full R-loop时，其Non-target strand会阻挡HNH核酸酶去结合Target strand, 这种结局就是两条链都不会被切割，从而保证了安全性。而guide序列和target DNA完全配对形成full R-loop之后，即“确认过眼神，遇上对的人”之后，该状态之下更大的R-loop空间会允许HNH结构域通过，进而结合target strand, 最终引发切割，HNH巨大的运动又将Non-target strand推给RuvC核酸酶，引发第二步切割，这个结构观察结果也与生化试验相符 （图3）。图3：scB酶活调控示意图：在没有形成full R-loop情况下（左），non-target strand DNA(NTS)通过空间位阻阻碍HNH核酸酶接近target strand （TS）,从而防止脱靶错切；当确定了正确的底物之后（中），更大的R-loop允许了HNH核酸酶结合TS，进行切割；HNH会进一步将NTS推给RuvC核酸酶，激发第二步切割，最终产生双链断裂。
Movie 2: IscB激活机制。通过non-target strand的空间走向来决定核酸酶切割行为。当是错误底物时，无法打开full R-loop, 因此阻碍进一步的切割，而正确的底物会打开full R-loop,最后激活双酶切割，实现双链断裂。这是关于了解分子的结构以及它们如何进行化学反应，研究这些Cas9远古结构为我们提供了一个新的起点，可以生成更强大、更易于使用的基因编辑工具。人们认为转座子是 CRISPR 系统的进化前体。 细菌内部的这些系统每分钟都在不断地被选择——大自然基本上已经掷骰子数十亿次，并找到了这些非常强大的工具。现在，通过以高分辨率定义它们，可以更好地利用它们的力量。还有很多谜团——比如为什么转座子使用 RNA 引导系统？RNA起什么作用？RNA自身能否进一步进化为更小尺寸？总之，这项工作从分子层面，向人们展示了Cas9的进化源头，比较了IscB与Cas9的进化关联。提供了高分辨的双酶控机制解释，为后基因组时代的基因编辑精准治疗提供了具有高度潜能的工具，为后续的高效编辑效率优化提供了蓝本和思路。据悉，本文的共同第一作者胡纯一博士将于8月开始在上海交大医学院基础医学院组建实验室，将继续从事新型基因编辑工具开发和精准医疗应用相关的研究工作。有兴趣的可以投递简历。另外，可爱龙实验室还有多个博后位置空缺，有兴趣的可以投递简历。https://jinshuju.net/f/ZqXwZt或扫描二维码投递简历IscB蛋白被鉴定出是由IS200/IS605转座子超家族一个独特子集编码的推定核酸酶，被认为可能是Cas9的祖先。张锋团队2021年science系统性的阐述了IscB蛋白在原核生物中广泛分布，并与Cas9共享结构域组成。此外，他们还发现了一个IS200/605超家族转座子中编码的不含HNH结构域的同源蛋白，命名为IsrB，以及一组更小的缺乏RuvC结构域的蛋白家族IshB。系统生物学分析进一步支持了IscB的“祖先”身份。更加有意思的是，研究表明Ignatius tetrasporus UTEX B 2012，一种陆生绿藻的叶绿体基因组中也鉴定出多个iscB基因座，这种真核IscB也同样具有DNA切割活性。提示这种早期RNA guided nuclease不仅存在于原核生物中，而且存在于真核生物中，极大地拓展了RNA引导系统的多样性。对iscB基因座ORF的上下游保守核苷酸序列进行检索发现，其上游存在一段高度保守序列，被命名为ωRNA（OMEGA，Obligate Mobile Element Guided Activity），而ωRNA中5’端是不保守的序列，该不保守的序列被认为可能发挥引导RNA的作用。张锋团队将这类IS200/IS605通过核酸酶结构域组成分类为IscB、IsrB和TnpB，其中，Ogeu lscB协同16 nt guide可以实现最大的插入/缺失率，加上其非常紧密的组装，因而有望成为下一代基因组编辑工具的候选者。然而但其功能以及发挥功能的机理还是未知的，因此这也需要高分辨率结构生物学来佐证。Gabriel Schuler, Chunyi Hu 和 Ailong Ke 团队首次报道了2.7埃DNA结合状态下的IscB-ωRNA-dsDNA冷冻电镜结构，并且还分别捕捉到3.1埃非激活状态（unlocked R-loop state）以及3.2埃激活状态（locked R-loop state）下的高分辨率结构。该项工作首先展现了IscB的组装原理：使用长达200 nt左右的RNA来替换绝大部分Cas9的结构域，从而实现自身蛋白结构的精简。有意思的是，ωRNA部分序列在结构上与Cas9的sgRNA非常类似，通过对比发现：ωRNA 的P1区与sgRNA的repeat:tracRNA duplex区高度重合； 而tracrRNA的stem loop 1对应ωRNA的psuedoknot, stem loop 3对应ωRNA的P5。此外蛋白层面IscB依然保留了高度保守的HNH和RuvC双酶活结构域，同时保留了串联RuvC的bridge helix。这三个结构域与Cas9高度重叠，这些结果十分确切地展示了IscB与Cas9的同源性。这种高效的RNA结构替换蛋白结果，让人印象深刻。此外，这些工作比较全面地解释了IscB酶活激活机制。在16 nt的引导序列和目标链没有完全匹配时，其非目标链会以空间位阻的形式阻碍HNH结构域结合目标链,最终两条链都不会被切割，保证了安全性。而当引导序列和目标链完全匹配了，会刺激HNH结构域迅速捕捉目标链并完成切割，同时，HNH的运动又将非目标链呈递给RuvC结构域，激活第二步切割。总之，这项工作从分子层面，十分确凿地向人们展现了IS200/IS605转座子家族（IscB）与Cas9的进化关联性，确切的证明了IscB是Cas9的祖先。同时这项工作高分辨率的机制解释为后续效率优化，依赖IscB的多重编辑器的开发提供了思路。此外，CRISPR/Cas编辑器一直朝着“没有最小只有更小”的方向迈进，这些工作优化出的450氨基酸长度的Cas9同源物，可能为后续基因编辑工具箱提供了革命性的工具。不过，关于IscB研究，仍然面临的一个挑战是：虽然 IscB-ωRNA 在试管中非常活跃，几分钟就能完成切割双链DNA，但它在改变真核哺乳细胞的染色体DNA 方面效率还不是很高。该工作展示的对于IscB-ωRNA的精细结构解析，为后续进一步优化IscB基因编辑工具提供了重要的结构和工作机制的支持。期待后续优化的IscB系统能在真核生物特别是哺乳动物细胞中有较高活性，展现小尺寸基因编辑系统在基因治疗中的优势。http://doi.org/10.1126/science.abq72201.Makarova, K.S., Wolf, Y.I., Iranzo, J., Shmakov, S.A., Alkhnbashi, O.S., Brouns, S.J.J., Charpentier, E., Cheng, D., Haft, D.H., Horvath, P. et al. (2020) Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nature reviews. Microbiology, 18, 67-83.2.Knott, G.J. and Doudna, J.A. (2018) CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science, 361, 866-869.3.Doudna, J.A. (2020) The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature, 578, 229-236.4.Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. and Liu, D.R. (2016) Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 533, 420-424.5.Kapitonov, V.V., Makarova, K.S. and Koonin, E.V. (2015) ISC, a Novel Group of Bacterial and Archaeal DNA Transposons That Encode Cas9 Homologs. Journal of bacteriology, 198, 797-807.6.Karvelis, T., Druteika, G., Bigelyte, G., Budre, K., Zedaveinyte, R., Silanskas, A., Kazlauskas, D., Venclovas, C. and Siksnys, V. (2021) Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature, 599, 692-696.【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经作者的允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。
BioArt的主编 2022-05-29 0